The Importance of Calcium Channels in Thyroid Cancer

Abstract

Matrix metalloproteinases (MMPs) are endopeptidases that participate in remodeling and degradation of the extracellular matrix (ECM). In cancer, the expression and activity of MMP2 and MMP9 is typically increased, which causes break down of both the ECM and the basement membrane, thus promoting invasion and metastasis. The Törnquist laboratory has previously showed that sphingosine-1-phosphate (S1P) stimulates invasion and migration of follicular ML-1 thyroid cancer cells and enhances both the secretion and activity of MMP2 and MMP9 via S1P receptors 1 and 3 (S1P1,3). In our first project, we introduced a new mechanism through which S1P, by activating S1P2, may attenuate invasion of thyroid cancer cells. We showed that in anaplastic C643 thyroid cancer cells, S1P reduces the expression, secretion and activity of MMP2, and to a lesser degree MMP9. This at least partially attenuates the invasion of these cells. Moreover, the S1P-induced attenuation of MMP2 is mediated through S1P2 and Rho-ROCK pathway, and by suppressing calpain activity in C643 cells. Disturbances in calcium (Ca2+) homeostasis can cause a variety of diseases, including cancer. Store-operated calcium entry (SOCE) is a central mechanism for cellular Ca2+ signaling, and for maintinaing the cellular Ca2+ balance. Depletion of Ca2+ stores in the endoplasmic reticulum trigger stromal interaction molecule 1 (STIM1) to activate Ca2+ release-activated Ca2+ channel protein 1 (ORAI1) channels on the plasma membrane, thus allowing the influx of Ca2+ to the cell. SOCE has been shown to play a vital role in tumorigenesis, and therefore changes in expression of STIM1 and ORAI1 has been shown to contribute to phenotypic alterations in malignant cells. In our second project we showed that the expression of both STIM1 and ORAI1 are increased in thyroid cancer. Knock-down of STIM1 or ORAI1 reduces proliferation, invasion and SOCE in ML-1 cells. We also demonstrated the same effect on proliferation and invasion in ML-1 cells, when knocking-down STIM1 with STIM1 siRNA loaded nanoparticles. Additionally, knock-down of STIM1 increases the expression of thyroid specific proteins and enhances the sensitivity to chemotherapy and increases iodine uptake in ML-1 cells. Studies have reported that the expression of thyroid hormone receptor β1 (TRβ1) is downregulated, whereas the expression of runt related transcription factor 2 (RUNX2) is upregulated, in many cancers, including thyroid cancer. In our third and last project we showed that inhibiting Ca2+ entry increases the expression of TRβ1 and decreases the expression of RUNX2 in ML-1 cells. In addition, the expression of TRβ1 is downregulated, whereas the expression of RUNX2 is upregulated in all studied thyroid cancer cell lines, when compared to primary thyroid cells. Overexpression of TRβ1 or silencing RUNX2 decreases proliferation and both basal and S1P-induced invasion in ML-1 cells. Furthermore, overexpression of TRβ1 increases the expression of thyroid specific proteins. These results suggest that in ML-1 cells the expression of TRβ1 and RUNX2 are Ca2+ dependent and overexpression of TRβ1 triggers the re-differentiation of aggressive and poorly differentiated ML-1 cells towards a more normal thyroid phenotype. In conclusion, all the above-mentioned proteins are important regulators of thyroid cancer and therefore they could function as potential therapeutic targets for the treatment of thyroid cancer. Since the thyroid cancer incidence is increasing worldwide and the aggressive forms of thyroid cancer lack effective treatment methods, new therapeutic targets would be desirable.

Matrix metalloproteinaser (MMP) är endopeptidaser som deltar i ommodellering och nedbrytning av extracellulärt matrix (ECM). I cancer är både uttrycket och aktiviteten av MMP2 och MMP9 vanligtvis förhöjda. Detta leder till nedbrytning av ECM och basalmembranet, vilket i sin tur främjar invasion och metastasering. Törnquists forskningsgrupp har tidigare visat att sfingosin-1-fosfat (eng: sphingosine-1-phosphate, S1P) stimulerar invasion och migration av follikulära ML-1 sköldkörtelcancerceller samt ökar utsöndringen och aktiviteten av MMP2 och MMP9 via S1P-receptorerna 1 och 3 (S1P1,3). I vårt första projekt upptäckte vi en ny mekanism genom vilken S1P, via aktivering av S1P2, kan dämpa invasion av sköldkörtelcancerceller. Vi visade att S1P i anaplastiska C643 sköldkörtelcancerceller minskar uttrycket, utsöndringen och aktiviteten av MMP2, och i mindre grad MMP9. Detta dämpar åtminstone delvis invasionen av dessa celler. Dessutom förmedlas den S1P-inducerade minskningen av MMP2 genom S1P2 och Rho-ROCK signalräckan och genom att inhibera kalpain-aktivitet i C643-celler. Störningar i kalcium (Ca2+)-homeostasen kan orsaka en mängd olika sjukdomar, inklusive cancer. Förrådsreglerat kalciuminflöde (eng: Store-operated calcium entry, SOCE) är en central mekanism för cellulär Ca2+ signalering och för att upprätthålla den cellulära Ca2+-balansen. När Ca2+-lagren i det endoplasmatiska nätverket töms förflyttar sig stromalt-interaktionsprotein 1 (eng: stromal interaction molecule 1, STIM1) till plasmamembranet för att aktivera kalciumutsöndringsaktiverat kalciumkanalprotein 1 (eng: Ca2+ release-activated Ca2+ channel protein 1, ORAI1)-kanaler, som i sin tur leder till inflöde av Ca2+ till cellen. SOCE har visat sig spela en viktig roll i utvecklingen av tumörer och därför har förändringar i uttryck av STIM1 och ORAI1 visat sig bidra till fenotypiska förändringar i maligna celler. I vårt andra projekt visade vi att uttrycket av både STIM1 och ORAI1 ökar i sköldkörtelcancer. Nedtystning av STIM1 eller ORAI1 minskar proliferation, invasion och SOCE i ML-1-celler. Samma effekt på proliferation och invasion kunde även visas i ML-1-celler, när vi nedtystade STIM1 med STIM1 siRNA-laddade nanopartiklar. Dessutom leder nedtystning av STIM1 till ökat uttryck av sköldkörtelspecifika proteiner, ökad känslighet för kemoterapi samt ökat jodupptag i ML-1-cellerna. Studier har rapporterat att uttrycket av sköldkörtelhormonreceptorn β1 (eng: thyroid hormone receptor β1, TRβ1) är nedreglerat, medan uttrycket av runt-relaterade transkriptionsfaktor 2 (eng: runt related transcription factor 2, RUNX2) är uppreglerat i många cancerformer, inklusive sköldkörtelcancer. I vårt tredje och sista projekt visade vi att inhibering av Ca2+-inträde ökar uttrycket av TRβ1 och minskar uttrycket av RUNX2 i ML-1-celler. Dessutom är uttrycket av TRβ1 nedreglerat, medan uttrycket av RUNX2 är uppreglerat i alla studerade sköldkörtelcancercellinjer jämfört med primära sköldkörtelceller. Överuttryck av TRβ1 eller nedtystandet av RUNX2 minskar proliferation samt basal och S1P-inducerad invasion i ML-1-celler. Dessutom ökar överuttryck av TRβ1 uttrycket av sköldkörtelspecifika proteiner. Dessa resultat antyder att i ML-1-celler är uttrycket av TRβ1 och RUNX2 Ca2+-beroende och att överuttryck av TRβ1 inducerar re-differentieringen av aggressiva och dedifferentierade ML-1-celler mot en mera normal sköldkörtelfenotyp. Sammanfattningsvis, alla ovan nämnda proteiner är viktiga reglerare av sköldkörtelcancer och därmed skulle de kunna fungera som potentiella terapeutiska mål för behandling av sköldkörtelcancer. Eftersom förekomsten av sköldkörtelcancer ökar över hela världen och de aggressiva formerna av sköldkörtelcancer saknar effektiva behandlingsmetoder skulle nya terapeutiska mål vara önskvärda.