Spatial control of angiogenesis by engineered patterns of Notch ligands

Abstract

Spatial control of angiogenesis by engineered patterns of Notch In tissue engineering and regenerative medicine, proper vascularization of engineered tissues is imperative, as diffusion of nutrients, oxygen and waste is limited in constructs larger than a few cells thick. Therefore, tissue vascularization has been extensively researched. However, most approaches rely on preset structural support for the cells provided by scaffolds and micro fluidic chips to instruct vascular organization, which limit the integration into engineered and native tissues. Self-assembly of vascular constructs by combinations of support material, cells and growth factors shows promise but is not capable of dictating structure and organization of the engineered vasculatures. Therefore, spatial control over vascularization is required for tissue engineered constructs to remain alive and functioning. The growth of vasculature from existing vessels towards the oxygen gradient, is a process called angiogenesis. During angiogenesis, migrating tip cells emerge from the vascular endothelium and sprout towards the oxygen gradient. Proliferating stalk cells follow their path and form a vascular tube. The selection of tip and stalk cell phenotypes is regulated via several cell signaling pathways, among which the Notch signaling pathwayhas a predominant role. The Notch signaling pathway is a highly conserved cell-cell signaling pathway involved in numerous cell fate decisions and the patterning of tissues. The Notch receptor Notch1 and ligands Dll4 and Jag1 are involved in angiogenesis. Here, Dll4/Notch1 signaling is responsible for tip and stalk cell selection and Jag1 modulates Dll4/Notch1 signaling, though the role of Jag1 in angiogenesis needs to be further elucidated. Notch signaling is involved in several (genetic) cardiovascular diseases as well as cancer. For therapeutic targeting of Notch, mostly soluble molecules have been used to inhibit signaling. However, systemic administration of these molecules gives rise to adverse effects and toxicity. Local activation of Notch signaling, especially to target angiogenesis has not been widely addressed. In this thesis, we have developed an in vitro method where we used spatial patterns of parallel lines of Notch signaling ligands to locally modulate endothelial tip/stalk cell selection and thereby gained spatial control over endothelial sprouting. The technical details of the protocol, optimization, important considerations and alternative approaches are also provided. Using the developed technology we have found that line patterns of Dll4 induced controlled unidirectional and restricted sprouting on the lines, resulting in localization of endothelial sprouts between the lines (negative patterning). Next, we used our method to investigate the role of Jag1 in endothelial patterning. In contrast to Dll4, we have found that Jag1 patterns did not exert control over endothelial sprouting location and direction. Gene expression profiles did not provide significant difference upon stimulation with Dll4 and Jag1 to explain the difference in control observed.Computational modeling of Notch signaling endothelial cells on patterns of ligand, revealed that underlying differences in signaling dynamics between Jag1 and Dll4 are likely the cause for the lack of control over endothelial sprouting exerted by Jag1. To study the potential of ligand patterning further, alternative techniques for complex patterning of ligands were considered and investigated, though further optimization is needed for their application. In summary, we have shown that the use of local presentation of the Notch ligand Dll4 results in spatial control over endothelial sprouting. Additionally, the potential of engineered patterns of ligands to control endothelial sprouting during angiogenesis is valuable for the design of biomaterials and engineering of organized vasculature for tissue engineering as well as for regenerative medicine. Furthermore, the method developed in this thesis allows for the screening of functional engineered ligands and could aid in revealing disease phenotypes by screening for mutations in ligands.

Spatial kontroll av angiogenes genom konstruerade mönster av Notch-ligander I vävnadsteknik och regenerativ medicin är vaskularisering av konstruerade vävnader nödvändigt, eftersom spridningen av näringsämnen, syre och avfall är begränsad i konstruktioner som är större än några celler i tjocklek. Därför har vävnadsvaskularisering i omfattande grad utforskats. De flesta infallsvinklarna är dock beroende av förbestämda stödstrukturer och mikofluidiska chip för att instruera vaskulär organisation, vilket begränsar integrationen i levande vävnader. Självkonstruktion av vaskulaturen genom kombinationer av celler och tillväxtfaktorer är lovande, men kan inte diktera strukturen och organisationen. Därför är spatial kontroll av vaskularisering nödvändig för att vävnadstekniska konstruktioner skall vara funktionella. Tillväxten av vaskulatur utgående från existerande kärl mot syregradienten är en process benämnd angiogenes. Under angiogenes framträder migrerande spetsceller från det vaskulära endotelet och rör sig mot syregradienten. Snabbväxande stjälkceller följer deras bana och bildar en vaskulär tub. Urvalet av spets- och stjälkceller styrs genom ett flertal cellsignaleringsvägar, av vilka cellsignaleringsvägen Notch har en framträdande roll. Notchsignaleringsvägen är en i hög grad konserverad cell-cell signaleringsväg inblandad i ett flertal cellödesbeslut och vävnadsmönstring. Notchreceptorn Notch1 och liganderna Dll4 och Jag1 är viktiga för angiogenes. Här är Dll4/Notch1-signalering ansvarig för spets-och stjälkcellsurval och Jag1 modulerar Dll4/Notch1-signalering. Dock bör rollen Jag1 spelar i angiogenes vidare utforskas. Notchsignalering är inblandad i flera (genetiska) hjärt- och kärlsjukdomar samt cancer. För terapeutiska interventioner inriktade på Notch har till största delen lösliga molekyler använts för att hämma signalering. Systemisk administrering av dessa molekyler ger dock upphov till skadliga effekter och toxicitet. Lokal aktivering av Notchsignalering, framförallt inriktad på angiogenes har inte i omfattande grad studerats. I denna avhandling har vi utvecklat en in vitro-metod där vi använde spatiala mönster av parallella linjer av Notchligander för att lokalt modulera urvalet av endotela spets- och stjälkceller och därmed få kontroll över endoteltillväxten. Vi har funnit att linjemönster av Dll4 inducerade kontrollerad enkelriktad och begränsad tllväxt vilket resulterade i endoteltillväxt mellan linjerna (negativ mönstring). Vi använde även vår metod för att utforska vilken roll Jag1 hade i endotelmönstring. Till skillnad från Dll4 påverkade Jag1 inte endoteltillväxtens plats och riktning. Genutrycksprofiler visade ingen signifikant skillnad efter stimulering med Dll4 och Jag1 som skulle förklara de observerade skillnaderna. Datamodellering av Notchsignalerande endotelceller på ligandmönster visade att underliggande skillnader i signaleringsdynamik mellan Jag1 och Dll4 sannolikt är orsaken till bristen på kontroll över endoteltillväxt hos Jag1. För att studera potentialen hos ligandmönstring vidare utforskades alternativa tekniker för komplex mönstring av ligander, dock krävs vidare optimering innan de kan tas i bruk I sammanfattning har vi visat att användningen av lokal presentation av Notchliganden Dll4 resulterar i spatial kontroll över endoteltillväxt. Mönster av ligander för att kontrollera endoteltillväxt vid angiogenes är värdefullt för skapandet av biomaterial och konstruktion av organiserad vaskulatur för vävnadskonstruktion samt regenerativ medicin. Slutligen möjliggör metoden utvecklad i denna avhandling screening av funktionella konstruerade ligander och kan bistå i avslöjandet av sjukdomsfenotyper genom screening av muterade ligander.